6. 简述RNA转录的过程?
答:(1)目的基因调取 体外操作DNA的主要步骤之一是提取载体DNA和所需要的外源目的基因。在细胞中DNA并非以游离态分子存在,而是和RNA及蛋白质结合在一起形成复合体。DNA纯化的基本步骤是:(1)从破坏的细胞壁和膜里释放出可溶性的DNA;(2)通过变性或蛋白质分解,使DNA和蛋白质的复合体解离;(3)将DNA从其它大分子中分离出来;(4)DNA浓度和纯度的光学测定。
(2)载体选择 外源DNA片段(目的基因)要进入受体细胞,必须有一个适当的运载工具将带入细胞内,并载着外源DNA一起进行复制与表达,这种运载工具称为载体。载体必须具备下列条件:①在受体细胞中,载体可以独立地进行复制。所以载体本身必须是一个复制单位,称复制子,具有复制起点。而且插入外源DNA后不会影响载体本身复制的能力。②易于鉴定、筛选。也就是说,容易将带有外源DNA的重组体与不带外源DNA的载体区别开来。③易于引入受体细胞。
(3)连接 外源DNA与载体DNA之间可以通过多种方式相连接,主要有以下几种:①粘性末端连接;②平头末端连接;③接头连接等。
(4)转化 任何外源DNA重组到载体上,然后转入受体细胞中复制繁殖,这一过程称为DNA的克隆。外源DNA进入受体细胞并使它获得新遗传特性的过程称为转化。转化作用是将外源DNA引入细胞的过程。
(5)筛选 由于细胞转化的频率较低,所以从大量的宿主细胞中筛选出带有重组体的细胞并不是很容易的,当前,在实验室中,常用的筛选手段有以下几种:① 插入失活;② 菌落原位杂交;③ 免疫学方法.此外,对重组体转化的鉴定还可以采用表现型的鉴定;对重组质粒纯化并重新转化;限制性酶切图谱的绘制;重组质粒上的基因定位等更深入的方法。