根据所学,综述如何保证PCR反应特异性?

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根据所学,综述如何保证PCR反应特异性?

保证PCR反应特异性,需从PCR反应体系和扩增参数等方面注意。反应体系中:①模板:纯度要高;②从位置、长度、二级结构、碱基分布、TM值以及末端修饰等方面合理设计引物③脱氧核苷三磷酸浓度一致,浓度不宜过高;④DNA聚合酶酶量不宜过多;⑤缓冲液中镁离子浓度达到最佳反应浓度。扩增参数包括温度、时间和循环次数。退火温度是保证PCR反应特异性前提,一般低于引物TM值5℃左右。根据扩增片段长度决定扩增时间,长度过大,适当延长每个步骤时间。循环次数为20-40次,不宜过多。

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